欧美精品一区二区三区四区,亚洲国产成人精品无码区在线秒播,日韩精品中文字幕无码专区,91麻豆精品一二三区在线

PCR反應(yīng)條件的選擇技巧

日期:2024-10-19 04:28
瀏覽次數(shù):83
摘要: PCR反應(yīng)條件的選擇技巧主要體現(xiàn)在溫度、時間和循環(huán)次數(shù)上,溫度過高,延伸時間不夠都會對實驗結(jié)果有很大的影響。PCR反應(yīng)條件三要素為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設(shè)置基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40 ~60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右...
  PCR反應(yīng)條件的選擇技巧主要體現(xiàn)在溫度、時間和循環(huán)次數(shù)上,溫度過高,延伸時間不夠都會對實驗結(jié)果有很大的影響。PCR反應(yīng)條件三要素為溫度、時間和循環(huán)次數(shù)。溫度與時間的設(shè)置基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點。在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40 ~60℃,引物退火并結(jié)合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法,除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

1、變性溫度與時間:變性溫度低,解鏈不完全是導(dǎo)致PCR 失敗的主要原因。一般情況下,93℃~94℃lmin足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性,就會導(dǎo)致PCR失敗。

2、退火(復(fù)性)溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多,引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇合適退火溫度的起點較為理想。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:
Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)
復(fù)性溫度=Tm值-(5~10℃)
在Tm值允許范圍內(nèi), 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間完全結(jié)合。

3、延伸溫度與時間:Taq DNA聚合酶的生物學(xué)活性:
70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃時, DNA合成幾乎不能進(jìn)行。
PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。 PCR延伸反應(yīng)的時間,可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長度而定,一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時間1min是足夠的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴(kuò)增 10Kb需延伸至15min。延伸進(jìn)間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對低濃度模板的擴(kuò)增,延伸時間要稍長些。
循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30~40次之間,循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。

t66y最新地址一地址二地址三| 亚洲AV无码久久久久网站蜜桃| 51成人精品午夜福利av免费七| 女女女女bbbbbb毛片在线| 人禽伦免费交视频播放| 国产乱子伦无套一区二区三区| 一本久久综合亚洲鲁鲁五月天| 亚洲欧美一区| 欧美大胆xxoo一二三 | 亚洲色欲色欲综合网站| 中文字幕不卡高清视频在线| 欧美日韩精品一区二区| 狠狠干夜夜| 美女把尿口扒开让男人玩| 国产专区免费资源网站| heyzo无码综合国产精品| 永久免费AV无码不卡在线观看| 午夜男女羞羞爽爽爽视频| 男男激情做爰gay片| 射进去| 婷婷综合久久| 欧美丰满xxxaaa片| 毛片精品| 久久人人玩人妻潮喷内射人人| 国产人妖乱国产精品人妖| 久久久久久AV无码免费看大片 | 精久久久| 午夜不卡视频| 久久中文字幕人妻丝袜系列 | 欧美激情乱人伦| 国产成人午夜福利高清在线观看| 无码高潮少妇毛多水多水| 亚洲日韩激情无码一区| 精品免费Av一区二区三区| 免费国产自线拍一欧美视频| 国产成人亚洲精品无码青青草原| 最近免费中文字幕MV在线电影| 亚洲va天堂va国产va久| 日本一区二区三区在线观看| 夹江县| 石屏县|