KI-67 抗原測定試劑盒說明書
實驗原理:
本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中血清素/血清胺(ST)水平。用純化的血清
素/血清胺(ST)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入
血清素/血清胺(ST)，再與 HRP 標記的血清素/血清胺(ST)抗體結(jié)合，形成抗體-
抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過徹 di 洗滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶 S 的催
化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血
清素/血清胺(ST)呈正相關(guān)。用酶標儀在 450nm 波長下測定吸光度（OD 值），通
過標準曲線計算樣品中血清素/血清胺(ST)濃度。
試劑盒特點:
1、高效、靈敏、特異的抗體;
2、穩(wěn)定的重復性和可靠性;
3、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體;
4、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養(yǎng)上清液、尿液等等多種標本類型;
5、節(jié)省實驗經(jīng)費。
試劑盒組成 :
1、30 倍濃縮洗滌液 20ml×1 瓶 7 終止液 6ml×1 瓶
2、酶標試劑 6ml×1 瓶 8 標準品（160pg/ml） 0.5ml×1 瓶
3、酶標包被板 12 孔×8 條 9 標準品稀釋液 1.5ml×1 瓶
4、樣品稀釋液 6ml×1 瓶 10 說明書 1 份
5、顯色劑 A 液 6ml×1 瓶 11 封板膜 2 張
6、顯色劑 B 液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1 個
標本要求:
1．標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應盡快進行實驗。
若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融
2．不能檢測含 NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。
樣本處理及要求：
1.血清：全血標本請于室溫放置 2 小時或 4℃過夜后于 1000g 離心 20 分鐘，取
上清即可檢測，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
2.血漿：可用 EDTA 或肝素作為抗凝劑，標本采集后 30 分鐘內(nèi)于 2 - 8°C 1000g
離心 20 分鐘，或?qū)吮痉庞?20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
3.組織勻漿：用預冷的 PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中
裂解的紅細胞會影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積
的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如 1g 的組織樣品對應 9mL 的 PBS，具體體
積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑）加
入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組織細胞，可以對勻漿液進
行超聲破碎，或反復凍融。將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘，取上清檢測。
4.細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標本：1000g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或
將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。
保存條件及有效期:
1．試劑盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6 個月。
試劑盒性能：
1. 靈敏度：zui 小的檢測濃度小于 1 號標準品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù) R 值為 0.990。
2. 特異性：不與其它細胞因子反應。
3. 重復性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于 10%。
操作步驟：
1. 標準品的稀釋：本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試
管中進行稀釋。
2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、
標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣 50μl，待測樣品孔
中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待測樣品 10μl（樣品最終稀釋度為 5
倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
3. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。
4. 配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用
5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后
棄去，如此重復 5 次，拍干。
6. 加酶：每孔加入酶標試劑 50μl，空白孔除外。
7. 溫育：操作同 3。
8. 洗滌：操作同 5。
9. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50μl，再加入顯色劑 B50μl，輕輕震蕩混勻，
37℃避光顯色 10 分鐘.
10. 終止：每孔加終止液 50μl，終止反應（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
11. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定
應在加終止液后 15 分鐘以內(nèi)進行。
注意事項：
1．試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板
開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2．濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)
果。
3．各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加
樣時間最好控制在 5 分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4．請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣
本 OD 值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n
倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6．底物請避光保存。
7．嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
8．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9．本試劑不同批號組分不得混用。